Single Molecule Localization Microscopy in Depth Using soSPIM and Adaptive Optics
Microscopie par Localisation de Molécules Individuelles en Profondeur Utilisant la Technologie soSPIM et l'Optique Adaptative
Résumé
Advances in scientific knowledge are often correlated with the development of new instrumental techniques. Biology is no exception to the rule. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy techniques, awarded by the Nobel Prize in Chemistry in 2014, has revolutionized the way biological samples are observed by allowing to overcome the resolution limit dictated by light diffraction (~200 nm) and previously considered insurmountable. Among these techniques, Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) allows to image the organization of proteins inside cells with the best spatial resolutions (~10 nm) and gives the possibility to follow their dynamics over time. These new capabilities open the way to a better understanding of the cellular machinery, essential to better fight against its dysfunctions at the origin of many diseases.However, the detection of single molecules for super-resolution imaging by SMLM is particularly challenging and requires both high optical sectioning and high signal collection efficiency. As a result, it is performed using specialized microscopy systems with extremely shallow sample penetration depths. The single-lens light sheet microscopy system developed in our team, named soSPIM, allows to overcome this limitation. By combining a deep optical sectioning with the use of a high numerical aperture objective, it allows the detection of individual molecules several tens of microns above a coverslip.Imaging whole volumes, such as whole cells, at these depths, however, rises new challenges. In excitation, light diffraction imposes a significant trade-off between the fineness of sectioning that can be achieved and the field of view. To overcome this, I sought to implement non-diffractive light sheet illumination to the soSPIM system. In detection, the performance of SMLM imaging depends directly on the optical quality of the system. Defects, called optical aberrations, appear systematically with the imaging depth. To correct these aberrations, I have implemented an adaptive optics system in the soSPIM microscope to allow precise 3D localization of individual molecules at depth. Finally, beyond the optical challenges, the acquisition and reconstruction procedures themselves present many difficulties. I have therefore developed several tools to consider spatial drifts and acquisition automation, and to reconstruct imaged volumes (~20x20x20 µm3) with nanometric resolutions. These developments have allowed the imaging of whole cells at 30 µm depth with resolutions of 5 nm radially (x, y) and 25 nm axially (z). This work provides a solid proof of concept of the soSPIM system's in depth SMLM imaging capability and paves the way for the observation of new biological structures at previously inaccessible nanometer resolutions.
Les avancées des connaissances scientifiques sont souvent corrélées au développement de nouvelles techniques instrumentales. La biologie ne déroge pas la règle. Le développement récent des techniques de microscopie à fluorescence de super-résolution, récompensé par le prix Nobel de chimie en 2014, a révolutionné la façon d’observer les échantillons biologiques en permettant de dépasser la limite de résolution dictée par la diffraction de la lumière (~200 nm) et considérée jusqu’alors comme insurmontable. Parmi ces techniques, la microscopie par localisation de molécules individuelles (SMLM) permet d’imager l’organisation de protéines à l’intérieur des cellules avec les meilleures résolutions spatiales (~ 10 nm) et donne la possibilité de suivre leur dynamique au cours du temps. Ces nouvelles capacités ouvrent la voie à une meilleure compréhension de la machinerie cellulaire, essentielle pour mieux lutter contre ses dysfonctionnements, à l’origine de nombreuses maladies.La détection de molécules individuelles pour l’imagerie de super-résolution par SMLM est particulièrement difficile. Elle nécessite à la fois un sectionnement optique important et une grande efficacité dans la collecte du signal de fluorescence. En conséquence, elle est réalisée à l’aide de systèmes de microscopie spécialisés et dont la profondeur de pénétration dans les échantillons est extrêmement réduite. Le système de microscopie à feuille de lumière mono-objectif développé au sein de notre équipe, nommé soSPIM, permet de dépasser cette limitation. En combinant un sectionnement optique en profondeur avec l'utilisation d’un objectif à forte ouverture numérique, il permet la détection de molécules individuelles plusieurs dizaines de micromètres au-dessus d’une lamelle.L’imagerie de volumes entiers, tels que des cellules complètes, à ces profondeurs pose cependant d’autres défis. En excitation, la diffraction de la lumière impose un compromis important entre la finesse du sectionnement qu’il est possible de réaliser et le champ de vue. Pour tenter de dépasser cela, j’ai cherché à implémenter au système soSPIM une illumination par feuille de lumière non diffractive. En détection, les performances de l’imagerie par SMLM dépendent directement de la qualité optique du système. Or des défauts appelés aberrations optiques apparaissent systématiquement avec la profondeur d’imagerie. Pour corriger ces aberrations, j’ai implémenté un système d’optique adaptative au microscope soSPIM afin de permettre une localisation précise et en 3D de molécules individuelles en profondeur. Enfin, au-delà des défis optiques, les procédures d’acquisition et de reconstruction présentent elles-mêmes de nombreuses difficultés. J’ai donc mis en place plusieurs outils permettant de corriger les dérives spatiales, d’automatiser les acquisitions et de reconstruire les volumes imagés (~20x20x20 µm3) avec des résolutions nanométriques. Ces développements ont permis l’imagerie de cellules entières à 30 µm de profondeur avec des résolutions de 5 nm radialement (x,y) et 25 nm axialement (z). Ils forment ainsi une preuve de concept solide de la capacité du système soSPIM à l’imagerie par SMLM en profondeur. Ils ouvrent la voie à l’observation de nouvelles structures biologiques à des résolutions nanométriques jusqu’à présent inaccessibles.
Origine : Version validée par le jury (STAR)